ПЛР. Патогенні Escherichia coli (STEC, ETEC, EPEC, EAEC, O157) та Clostridioides difficile, якісне визначення (кал, рект. зішкріб)

1. Чи підходить мені цей аналіз?
Дослідження призначене для одночасного виявлення патогенних варіантів Escherichia coli та гіпервірулентного Clostridioides difficile – бактеріальних збудників, які можуть спричиняти гострі кишкові інфекції та інфекційну діарею.
Більшість штамів E. coli є частиною нормальної мікрофлори кишечника та не спричиняють захворювань. Однак окремі патогенні варіанти мають специфічні фактори вірулентності та можуть викликати від водянистої діареї до геморагічного коліту й тяжких ускладнень.
Аналіз визначає:
•    STEC – шигатоксин-продукуючу E. coli;
•    ETEC – ентеротоксигенну E. coli;
•    EPEC – ентеропатогенну E. coli;
•    EAEC – ентероагрегативну E. coli;
•    E. coli O157;
•    гіпервірулентний Clostridioides difficile.
Аналіз може бути доцільним якщо:
•    є гостра або тривала діарея;
•    з’явилися біль і спазми в животі, часті рідкі випорожнення, нудота або інші симптоми кишкової інфекції;
•    у випорожненнях з’явилася кров;
•    симптоми виникли після подорожі, зміни харчування або вживання потенційно контамінованої їжі чи води;
•    діарея виникла під час або після антибактеріальної терапії;
•    необхідно провести диференційну діагностику бактеріальних кишкових інфекцій;
•    потрібно одночасно перевірити декілька клінічно значущих бактеріальних збудників..
Коли цей аналіз найбільш інформативний?
Дослідження найбільш інформативне в період активних симптомів кишкової інфекції, особливо при гострій або тривалій діареї.
Мультиплексна ПЛР особливо доцільна, коли за клінічними проявами складно визначити конкретного збудника, оскільки дозволяє за одне дослідження перевірити декілька патогенних варіантів E. coli та гіпервірулентний C. difficile.

2. Що показує аналіз?
Дослідження виявляє ДНК та специфічні генетичні маркери вірулентності бактеріальних збудників у біологічному матеріалі.
Дослідження одночасно визначає:
•    STEC – stx1/stx2: гени шига-токсинів 1 та 2;
•    EPEC – eaeA: ген, пов’язаний зі здатністю бактерії прикріплюватися до епітеліальних клітин кишечника;
•    ETEC – lt/st: гени термолабільного та термостабільного ентеротоксинів;
•    EAEC – aggR: ген-регулятор факторів вірулентності ентероагрегативної E. coli;
•    E. coli O157 – маркер серогрупи O157;
•    гіпервірулентний C. difficile – tcdC Δ117: мутацію, характерну для гіпервірулентного штаму.

Виявлення відповідного маркера може свідчити про наявність патогенного варіанта бактерії, який може бути причиною гастроентериту або інфекційної діареї.
Окремі збудники можуть бути пов’язані з різними клінічними проявами:
•    STEC, зокрема O157 – діарея, геморагічний коліт, у частині випадків – гемолітико-уремічний синдром;
•    ETEC – водяниста діарея, зокрема «діарея мандрівників»;
•    EPEC – діарейні захворювання, особливо в дітей раннього віку;
•    EAEC – гостра або тривала діарея, зокрема діарея мандрівників;
•    гіпервірулентний C. difficile – може бути пов’язаний із антибіотик-асоційованою діареєю та тяжчим перебігом інфекції.

3. Як проводиться дослідження?
Після надходження зразка до лабораторії проводиться кілька етапів дослідження.
1. Підготовка зразка
Із біологічного матеріалу виділяють генетичний матеріал (ДНК) можливих бактеріальних збудників.
2. Ампліфікація ДНК
За допомогою методу Real-Time PCR відбувається багаторазове копіювання специфічних ділянок ДНК та одночасне визначення генетичних маркерів STEC, EPEC, ETEC, EAEC, E. coli O157 і гіпервірулентного C. difficile.
Завдяки мультиплексному формату за одну реакцію можна дослідити одразу декілька бактеріальних мішеней.
3. Аналіз результатів
Спеціальне програмне забезпечення аналізує отримані сигнали та визначає:
•    чи виявлені гени stx1/stx2 – маркери STEC;
•    чи виявлений ген eaeA – маркер EPEC;
•    чи виявлені гени lt/st – маркери ETEC;
•    чи виявлений ген aggR – маркер EAEC;
•    чи виявлена Escherichia coli O157;
•    чи виявлений маркер гіпервірулентного Clostridioides difficile.
Дослідження виконується на ампліфікаторі Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System, який забезпечує автоматичну реєстрацію сигналів під час ПЛР у реальному часі
Фото CFX96

4. Як підготуватися до відбору біологічного матеріалу 
Правильна підготовка допомагає отримати максимально достовірний результат.
Підготовка залежить від виду біологічного матеріалу – калу або ректального зішкрібу.
Якщо біоматеріал – кал:
•    спеціальної дієти перед дослідженням не потрібно;
•    матеріал рекомендовано здавати до початку антибактеріальної терапії;
•    якщо ви вже приймаєте антибіотики або інші протимікробні препарати, повідомте про це лікаря;
•    не використовуйте перед відбором калу проносні засоби, ректальні свічки та клізми, якщо інше не рекомендовано лікарем;
•    бажано не проводити дослідження одразу після процедур або досліджень із введенням контрастних речовин у шлунково-кишковий тракт;
•    при гострій кишковій інфекції матеріал бажано здати якомога раніше після появи симптомів, коли кількість збудника у випорожненнях може бути найбільшою.

Якщо біоматеріал – ректальний зішкріб:
•    спеціальної дієти або голодування перед дослідженням не потрібно;
•    матеріал бажано відбирати до початку антибактеріальної терапії;
•    якщо антибактеріальна терапія вже розпочата, необхідно повідомити про це лікаря;
•    перед процедурою не проводити клізму та не використовувати ректальні свічки або інші місцеві препарати, якщо інше не рекомендовано лікарем;
•    безпосередньо перед відбором не потрібно проводити спеціальне очищення прямої кишки;
•    відбір ректального зішкрібу проводить лікар або інший кваліфікований медичний працівник.
Важливо: не припиняйте призначену антибактеріальну або іншу терапію самостійно. Якщо дослідження необхідно провести на фоні лікування, повідомте про препарати лікаря – це потрібно враховувати при оцінці результату.

5. Як правильно відібрати зразок біологічного матеріалу?
Для дослідження використовують кал або ректальний зішкріб.
Кал:
•    перед дефекацією спорожнити сечовий міхур, щоб сеча не потрапила до зразка.
•    дефекацію провести в чисту суху ємність або на чисту суху поверхню. не відбирати кал безпосередньо з унітаза.
•    за допомогою ложечки стерильного контейнера відібрати невелику кількість матеріалу з кількох ділянок.
•    помістити кал у стерильний герметичний контейнер без консервантів та щільно закрити.
•    не допускати потрапляння до зразка сечі, води, туалетного паперу, дезінфекційних засобів та інших сторонніх домішок.
•    матеріал бажано доставити до лабораторії якомога швидше.

Ректальний зішкріб
•    відбір проводить лікар або інший кваліфікований медичний працівник.
•    матеріал отримують із прямої кишки за допомогою стерильного інструменту відповідно до затвердженої процедури відбору.
•    після відбору зразок поміщають у відповідну транспортну систему.
•    матеріал маркують та передають до лабораторії з дотриманням установлених умов зберігання і транспортування.
Як транспортувати матеріал?
Матеріал бажано доставити до лабораторії якнайшвидше.

6. Як виглядає результат?
У лабораторному висновку зазначаються:
•    результат визначення STEC (stx1/stx2); 
•    результат визначення EPEC (eaeA); 
•    результат визначення ETEC (lt/st); 
•    результат визначення EAEC (aggR); 
•    результат визначення Escherichia coli O157; 
•    результат визначення гіпервірулентного Clostridioides difficile; 
•    якісна оцінка отриманого результату. 
Можливі варіанти результату:
•    STEC (stx1/stx2) – ВИЯВЛЕНО / не виявлено; 
•    EPEC (eaeA) – ВИЯВЛЕНО / не виявлено; 
•    ETEC (lt/st) – ВИЯВЛЕНО / не виявлено; 
•    EAEC (aggR) – ВИЯВЛЕНО / не виявлено; 
•    E. coli O157 – ВИЯВЛЕНО / не виявлено; 
•    гіпервірулентний C. difficile – ВИЯВЛЕНО / не виявлено. 
Не виявлено
ДНК відповідного збудника або його генетичні маркери у досліджуваному зразку не виявлені.
Виявлено
У досліджуваному зразку виявлено ДНК відповідного збудника або специфічний генетичний маркер патогенного варіанта бактерії.
В одному зразку можуть бути одночасно виявлені декілька мішеней, оскільки дослідження передбачає одночасне визначення кількох патогенних варіантів E. coli та гіпервірулентного C. difficile.

7. Як інтерпретувати результат?
Якщо всі досліджувані маркери не виявлені
У досліджуваному зразку не виявлено генетичних маркерів патогенів, які входять до складу панелі.
Негативний результат не виключає кишкову інфекцію, спричинену іншими бактеріями, вірусами або паразитами, які цим дослідженням не визначаються.
Якщо виявлено один із маркерів
У зразку виявлено генетичний маркер відповідного патогенного варіанта бактерії.
Клінічне значення залежить від виявленої мішені:
•    STEC (stx1/stx2) – виявлено маркери шигатоксин-продукуючої E. coli. Такі штами можуть бути пов’язані з діареєю, геморагічним колітом та, в окремих випадках, гемолітико-уремічним синдромом. 
•    EPEC (eaeA) – виявлено маркер ентеропатогенної E. coli, яка може бути причиною гострої діареї. 
•    ETEC (lt/st) – виявлено маркери ентеротоксигенної E. coli, яка найчастіше асоціюється з водянистою діареєю, зокрема діареєю мандрівників. 
•    EAEC (aggR) – виявлено маркер ентероагрегативної E. coli, яка може бути пов’язана з гострою або тривалою діареєю. 
•    E. coli O157 – виявлено маркер серогрупи O157, яка може бути пов’язана з геморагічним колітом та ризиком розвитку гемолітико-уремічного синдрому. 
•    гіпервірулентний Clostridioides difficile – виявлено маркер tcdC Δ117, характерний для гіпервірулентного варіанта C. difficile, який може бути пов’язаний з антибіотик-асоційованою діареєю. 
Якщо виявлено декілька маркерів
У зразку одночасно виявлено генетичні маркери декількох патогенів. У такому випадку клінічне значення кожного результату оцінює лікар з урахуванням симптомів, перебігу захворювання, анамнезу та інших лабораторних даних.
Результат ПЛР не використовується окремо від клінічної картини для вибору лікування. Тактику подальшого ведення визначає лікар.
Якість дослідження
У тест-системі використовується внутрішній контроль, який дозволяє контролювати виділення нуклеїнових кислот і можливе інгібування ПЛР.
Також застосовується система UDG-dUTP, призначена для зниження ризику контамінації продуктами попередніх реакцій ПЛР. 
Дослідження входить в сферу акредитації ISO15189 та ISO9001 – стандартів, що визначають вимоги до якості та компетентності медичних лабораторій, а також систем управління якістю.

8. Обмеження аналізу
Дослідження визначає лише ті патогени та генетичні маркери, які входять до складу панелі.
Результат дослідження необхідно оцінювати разом із клінічною картиною та іншими даними пацієнта.
На результат можуть впливати:
•    неправильний відбір або транспортування матеріалу;
•    недостатня кількість ДНК збудника у зразку;
•    відбір матеріалу на пізньому етапі захворювання;
•    прийом антибактеріальних препаратів;
•    наявність у зразку речовин, які інгібують ПЛР.
ПЛР визначає генетичний матеріал та специфічні маркери вірулентності, але не визначає чутливість бактерій до антибактеріальних препаратів.
Також виявлення ДНК не завжди означає, що саме цей мікроорганізм є єдиною причиною симптомів. Результат необхідно оцінювати в комплексі з клінічною картиною. Саме тому у певних клінічних ситуаціях лікар може рекомендувати додаткові дослідження.

9. Що робити після отримання результату?
Не рекомендується самостійно розпочинати лікування антибактеріальними препаратами лише на підставі лабораторного висновку.
Лікар оцінює:
•    клінічні симптоми;
•    тривалість та характер діареї;
•    результати ПЛР;
•    прийом антибактеріальних препаратів;
•    епідеміологічний анамнез;
•    результати інших лабораторних досліджень.
Якщо ПЛР виявляє один або декілька патогенних маркерів, лікар визначає їх клінічне значення та необхідність лікування. За потреби можуть бути призначені додаткові дослідження, зокрема бактеріологічний посів для виділення збудника та визначення його чутливості до антибактеріальних препаратів.
Якщо результат негативний, але симптоми зберігаються, можуть бути рекомендовані додаткові дослідження на інші причини кишкової інфекції, зокрема ПЛР-панелі на інші бактеріальні та вірусні збудники або паразитологічні дослідження.

FAQ
Чим це дослідження відрізняється від звичайного аналізу на E. coli?
Більшість E. coli є нормальною частиною кишкової мікрофлори. Цей тест шукає специфічні генетичні маркери патогенних варіантів E. coli – STEC, ETEC, EPEC, EAEC та O157, які можуть бути пов’язані з кишковими інфекціями. 
Чи визначає аналіз чутливість до антибіотиків?
Ні. Дослідження визначає генетичні маркери патогенних бактерій, але не визначає їх чутливість до антибактеріальних препаратів.
Чим ПЛР відрізняється від бактеріологічного посіву?
ПЛР безпосередньо визначає специфічні ділянки генетичного матеріалу та фактори вірулентності збудників без необхідності їх попереднього вирощування.
Бактеріологічний посів передбачає культивування життєздатних бактерій на поживних середовищах. Для окремих бактерій після виділення культури може проводитися визначення чутливості до антибактеріальних препаратів.
Тому методи вирішують різні діагностичні завдання: ПЛР дозволяє швидко ідентифікувати конкретні генетичні мішені патогенів, а бакпосів – виділити життєздатний мікроорганізм і, за потреби, оцінити його антибіотикочутливість.
Чи потрібне направлення лікаря?
Направлення не є обов’язковим. Однак при симптомах гострої кишкової інфекції консультація лікаря допоможе правильно обрати дослідження та інтерпретувати отриманий результат.

Які додаткові дослідження можуть бути рекомендовані?
Залежно від клінічної ситуації лікар може рекомендувати:
•    ПЛР. Бактеріальні гострі кишкові інфекції (Aeromonas spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Salmonella spp., Vibrio spp., Clostridium difficile toxin B, Yersinia enterocolitica) – P201 – для розширення пошуку бактеріальних збудників, які не входять до даної панелі. https://www.csdlab.ua/analyzes/hostri-kyshkovi-infektsiyi/plr-bakterial…
•    ПЛР. Вірусні гострі кишкові інфекції (аденовірус, астровірус, ротавірус, норовірус GI та GII, саповірус) – P202 – якщо є підозра на вірусну природу кишкової інфекції. https://www.csdlab.ua/analyzes/hostri-kyshkovi-infektsiyi/plr-virusni-h…
•    ПЛР. Гострі кишкові інфекції, розширена панель – P135 – комплексне дослідження на бактеріальні та вірусні збудники гострих кишкових інфекцій. https://www.csdlab.ua/analyzes/hostri-kyshkovi-infektsiyi/plr-skryninh-…
•    Виявлення носійства збудників кишкових інфекцій (сальмонели, шигели, ЕПКП). Чутливість до антибіотиків ДДМ – A036 – бактеріологічне дослідження з можливістю визначення чутливості виділених збудників до антибактеріальних препаратів. https://www.csdlab.ua/analyzes/profilaktychni-bakteriolohichni-doslidzh…
•    Аналіз калу на кишкові паразити (Parasep) – S235 – при підозрі на паразитарну причину діареї або тривалих кишкових симптомів. https://www.csdlab.ua/analyzes/analiz-kalu/analiz-kalu-na-kyshkovi-para…
•    Clostridium difficile (токсин A/B), антиген у калі EIA, якісно – S160 – для додаткового обстеження при підозрі на C. difficile-асоційовану інфекцію. https://www.csdlab.ua/analyzes/diahnostyka-inshykh-infektsiy/clostridiu…